土壤3种四环素类抗生素（金霉素、土霉素和四环素）的测定高校液相色谱-三重四极杆质谱法

 

 

 

1  范围

 

    本文件规定了测定土壤中3种四环素类抗生素的测定高效液相色谱-三重四级杆质谱法原理、试剂材料、仪器设备、样品采集和制备、分析测试和质量控制等技术内容。 

 

    本文件适用土壤中金霉素、土霉素和四环素的测定，方法检出限和测定下限详见附录A。

 

 

2  规范性引用文件

 

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

 

    HJ613土壤干物质和水分的测定重量法

 

    HJ/T166土壤环境监测技术规范

 

 

3  术语和定义

 

    本文件没有需要界定的术语和定义。

 

 

4  方法原理

 

    使用乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液，经水平振荡提取土壤样品中四环素类抗生素，提取液经冷冻离心后通过固相萃取柱净化，经浓缩后待测，使用高效液相色谱-三重四级杆质谱法，电离方式为ESI(+)，采用多反应监测(MRM)模式进行测定，采用外标法定量。

 

 

 

 

5  试剂和材料

 

5.1  实验用水：电阻率≥18MΩ·cm，其余指标应符合GB/T6682中表1的一级标准。

 

5.2  盐酸：优级纯。

 

5.3  盐酸溶液：ρ（HCl）=0.5mol/L。准确量取4.17ml盐酸（5.1）用实验室去离子水定容至100ml。

 

5.4 乙腈：优级纯。

 

5.5  甲醇：优级纯。

 

5.6  甲酸：优级纯。

 

5.7  0.1%甲酸水溶液：准确移取1.0mL甲酸加入1000mL水中，混匀。

 

5.8  0.1%甲酸乙腈溶液：移取1.0mL甲酸加入1000mL乙腈中，混匀。

 

5.9  金霉素、土霉素、四环素：有证标准物质含量（99%以上）。

 

5.10  金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（100mg/L）：称取0.0100g金霉素、土霉素、四环素（5.9），用甲醇（5.5）溶解并定容至100mL；于4°C冷藏、避光保存，或市售有证标准溶液。

 

5.11  金霉素、土霉素、四环素标准使用液（100μg/L）：移取100.0μL金霉素、土霉素、四环素标准贮备液（5.10），用甲醇（5.5）定容至100mL。

 

5.12  样品提取液（Mclvaine缓冲溶液：乙腈=7:3）：称取磷酸氢二钠27.6g，柠檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二钠盐37.2g，调节pH约等于2，用水溶解后稀释并定容至1000mL；移取Mclvaine缓冲溶液350mL，用乙腈稀释定容至500mL。

 

5.13  固相萃取柱：规格为6mL/500mgHLB柱。

 

5.14氮气：纯度≥99.999%。

 

5.15石英砂。

 

 

6  仪器和设备

 

6.1  高效液相色谱-三重四极杆质谱仪：配有电喷雾离子化源（ESI）或其他等效离子源。

 

6.2  分析天平：精度为0.0001g。

 

6.3  浓缩装置：氮吹浓缩仪或其他类型的等性能相当的设备。

 

6.4  固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。

 

6.5  色谱柱：C18高效液相色谱柱（规格2.1mm×100mm，1.7μm）或其他性能相近的色谱柱。

 

6.6  HY-2A调速多用振荡器。

 

6.7  高速冷冻离心机。

 

6.8  移液枪：5μL、10μL、20μL、50μL、100μL。

 

6.9  冷冻干燥仪。

 

6.10  涡旋振荡器。

 

 

7  样品

 

7.1  样品的采集和保存样品

 

    采集参照HJ/T166的相关规定执行，采集具有代表性的土壤样品，立即置于棕色磨口玻璃瓶中，用锡箔纸封口于4°C条件下冷藏。7d内完成提取，提取液在30d内完成分析工作。

 

7.2  样品的制备

 

7.2.1  土壤的冻干：将采集的样品挑除石块树枝，挖出装入培养皿中并用保鲜膜密封置于冻干机上冻干48h以上，冻干量一般为分析用量的3倍以上为宜。

 

7.2.2  干物质含量的测定：按照HJ613测定土壤样品干物质含量。

 

7.2.3  土壤中抗生素提取：称取2.0g冷冻干燥土壤样品于50mL离心管中，加入样品提取液（5.12）10mL，置于调速多用振荡器（6.6）中振荡45min，在4500r/min条件下冷冻离心10min后收集上清液，重复提取2次，然后加去离子水稀释至200mL，待净化。

 

7.2.4  净化：依次用3mL甲醇（5.5）、3mL0.5mol/LHCl（5.3）溶液、3mL水活化HLB固相萃取小柱（5.13），以5mL/min速度将提取液或待净化液通过固相萃取柱，然后依次用5mL5%甲醇溶液、5mL水淋洗固相萃取柱。真空泵抽干萃取柱，保持30min，最后用5mL甲醇洗脱，洗脱液在氮吹仪浓缩至小于1mL后，用1mL甲醇定容，涡旋溶解5min，过0.22μm滤膜后测定。

 

 

 

 

8  分析步骤

 

8.1  仪器参考条件

 

8.1.1  高效液相色谱仪参考条件见表1和表2。

 

表1高效液相色谱仪分析条件

 

流动相	A：0.1%甲酸溶液（4.6）B：0.1%甲酸乙腈（4.7）
流速	0.2mL/min
柱温	30°C
进样体积	2.0μL

 

表2梯度洗脱程序

 

时间（min）	流动相A(%)	流动相B(%)
0	90	10
1	90	10
5	40	60
6	5	95
8	90	10

 

 

8.1.2  离子源条件见表3。

 

表3离子源条件

 

离子源	电喷雾离子源（ESI），正离子模式
毛细管电压	4000V，干燥气体温度：350°C，雾化器压力：35psi
干燥气体流速	10L/min

 

 

8.1.3多离子反应

 

    监测方式（MRM）具体条件参见附录C，对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。

 

8.2  标准曲线的建立

 

    准确移取一定体积的金霉素、土霉素、四环素标准使用液（5.11），用甲醇（5.5）稀释，分别配置7种不同浓度的溶液，1.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L标准系列，待测。由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的响应值为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，建立标准曲线。

 

8.3  样品的测定

 

    取按（7.2）制备好的待测试样，按照与绘制校准曲线相同的仪器分析条件进行测定。当待测试样浓度超出标准曲线线性范围时，样品使用甲醇稀释后再测定。

 

8.4  空白试验

 

    使用石英砂，按照(7.2)进行样品制备，与试样相同的测定条件（8.1）进行空白试样的测定。

 

 

 

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