畜禽肉中９种生物胺的测定液相色谱Ｇ串联质谱法

 

 

 

 

１、范围

 

    本文件规定了畜禽肉中色胺、βＧ苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺的液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.

 

    本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉中色胺、βＧ苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、章鱼胺、酪胺、亚精胺和精胺的测定.

 

 

 

２、规范性引用文件

 

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.

 

    GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法

 

 

３、术语和定义

 

    本文件没有需要界定的术语和定义.

 

 

４、原理

 

    试样中的生物胺用５％三氯乙酸溶液提取,正己烷除脂,经丹磺酰氯衍生,液相色谱Ｇ串联质谱仪测定,内标法定量.

 

 

５试剂或材料

 

    除非另有规定,在分析中仅使用分析纯试剂,水为符合GB/T６６８２规定的一级水.

 

５.１试剂

 

５.１.１ 乙腈(CH３CN):色谱纯.

 

５.１.２ 三氯乙酸(CCl３COOH).

 

５.１.３ 丙酮(CH３COCH３):色谱纯.

 

５.１.４ 正己烷(C６H１４):色谱纯.

 

５.１.５ 浓氨水(NH３ŰH２O).

 

５.１.６ 碳酸氢钠(NaHCO３).

 

５.１.７ 碳酸钠(Na２CO３).

 

５.１.８ 氢氧化钠(NaOH).

 

５.１.９ 浓盐酸(HCl):１２mol/L,优级纯.

 

５.１.１０ 丹磺酰氯(C１２H１２ClNO２S):纯度＞９９％.

 

５.１.１１ 乙酸乙酯(CH３CH２OOCCH３):色谱纯.

 

５.１.１２ 甲酸(HCOOH).

 

５.２ 溶液的配制

 

５.２.１ 三 氯乙酸溶液(５％):称取１０g三氯乙酸于２５０mL锥形瓶中,加２００mL水,超声充分溶解.

 

５.２.２ 氢氧化钠溶液(１mol/L):称取４g氢氧化钠,加１００mL水溶解.

 

５.２.３ 碳酸钠Ｇ碳酸氢钠缓冲溶液:称取１８.７g碳酸钠以及１g碳酸氢钠于５００mL锥形瓶中,加３００mL１NY/T４４３８—２０２３水溶解,用１mol/LNaOH溶液(５.２.２)调节pH至１１.５.

 

５.２.４ 丹磺酰氯丙酮溶液(１０mg/mL):准确称取１００mg丹磺酰氯于１５mL离心管中,加１０mL丙酮(５.１.３)溶解,临用现配.

 

５.２.５ 盐酸溶液(０.１mol/L):在８００mL水中加８.３mL浓盐酸(５.１.９),加水至１０００mL.

 

５.２.６ 甲酸溶液(０.１％):在８００mL水中加１.０mL甲酸(５.１.１２),加水至１０００mL.

 

５.３ 标准品

 

    ９种生物胺和２种同位素内标物标准品:纯度≥９７％,中英文名称、CAS号和分子式见附录A.

 

５.４ 标准溶液的制备

 

５.４.１ 混合标准储备溶液(１０mg/mL):分别称取各１００mg(以生物胺的单体计,精确至０.１mg)９种生物胺标准品,用０.１mol/L盐酸溶液(５.２.５)溶解并定容至１０mL棕色容量瓶中,配制成质量浓度为１０mg/mL的混合标准储备溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期６个月.

 

５.４.２ 混合标准工作溶液(１mg/mL):准确移取混合标准储备溶液(５.４.１)１mL于１０mL棕色容量瓶中,用０.１mol/L盐酸溶液(５.２.５)定容,配制成浓度为１mg/mL的混合标准工作溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期３个月.

 

５.４.３ 混合同位素内标储备溶液(０.１mg/mL):分别称取２种生物胺同位素内标物标准品１mg(精确至０.１mg),用０.１mol/L盐酸溶液(５.２.５)溶解并定容至１０mL棕色容量瓶中,配制成质量浓度为０.１mg/mL的混合同位素内标储备溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期６个月.

 

５.４.４ 混合同位素内标工作溶液(１μg/mL):准确移取混合同位素内标储备溶液(５.４.３)０.１mL于１０mL棕色容量瓶中,用０.１mol/L盐酸溶液(５.２.５)定容,配制成浓度为１μg/mL的混合同位素内标工作溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期３个月.

 

５.５ 材料

 

５.５.１ 陶瓷均质子.

 

５.５.２ 微孔滤膜:０.２２μm,有机系.

 

 

６、仪器设备

 

６.１ 液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI).

 

６.２ 天平:感量０.０１g和０.００００１g.

 

６.３ pH计.

 

６.４ 涡旋振荡器.

 

６.５ 往复式振荡器.

 

６.６ 离心机:转速≥８０００r/min.

 

６.７ 恒温水浴振荡器.

 

６.８ 氮吹仪.

 

 

 

７、试样的制备与保存

 

７.１ 试样制备取适量刚屠宰后新鲜的空白供试样品,绞碎,并使均质.

 

    a)取均质后的供试样品,作为供试试样;

 

    b)取均质后的空白样品,作为空白试样;

 

    c)取均质后的空白样品,添加适宜浓度的混合标准工作溶液,作为空白添加试样.

 

７.２ 试样保存－１８°C以下保存.

 

 

８、测定步骤

 

８.１ 提取净化

 

    称取５g试样(精确至±０.０５g)于５０mL具塞离心管中,加２粒陶瓷均质子,加０.２５mL混合同位素内标工作溶液(５.４.４)和１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１),加盖涡旋振荡３０s,用往复式振荡器振荡提取１５min,于不低于８０００r/min下离心１０min,上清液转移至５０mL容量瓶中.残渣用１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１)重复提取１次,合并上清液,混匀,用５％三氯乙酸溶液(５.２.１)定容至刻度.准确移取上述溶液１０mL于５０mL具塞离心管中,加１０mL正己烷(５.１.４),加盖涡旋振荡５min,于不低于５０００r/min离心５min.弃去上层有机相,向下层水相中加１０mL正己烷(５.１.４)重复提取１次,合并下层水相作为待衍生溶液.

 

８.２ 衍生

 

    准确移取１.０mL待衍生溶液,置于１０mL具塞离心管中,加１mLpH１１.５的碳酸钠Ｇ碳酸氢钠缓冲溶液(５.２.３),涡旋混匀１min,加１mL１０mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液(５.２.４),立即加盖涡旋混匀１min后,置于恒温水浴振荡器上于６０°C水浴下避光振荡１５min.加０.１mL浓氨水(５.１.５),涡旋混匀３０s,静置１５min冷却至室温,加３mL乙酸乙酯(５.１.１１)涡旋振荡１min,吸取上层有机相于另一１０mL具塞离心管中,下层水相用３mL乙酸乙酯(５.１.１１)重复提取１次,合并２次有机相,在４０°C水浴下氮气吹干,准确加１.０mL乙腈(５.１.１)溶解残渣,涡旋混匀,过０.２２μm滤膜后供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.

 

８.３ 标准曲线的制备

 

    准确移取混合标准工作溶液(５.４.２)和混合同位素内标工作溶液(５.４.４)适量,用１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１)稀释,配制成生物胺浓度分别为１.０μg/mL、２.０μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL和２００μg/mL(２种同位素内标浓度均为５μg/L)的系列溶液,按照８.２步骤进行衍生反应,得到质量浓度为１.０μg/mL、２.０μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL和２００μg/mL的系列标准溶液(２种同位素内标浓度均为５μg/L),供液相色谱Ｇ串联质谱仪测定.以标准物特征离子色谱峰的峰面积与同位素内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准工作曲线,求回归方程和相关系数.

 

８.４、测定步骤

 

８.４.１  液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下:

 

    a)色谱柱:C１８柱(１００mm×２.１mm,粒径２.７μm),或相当者;

 

    b)流动相:乙腈(５.１.１)和０.１％甲酸溶液(５.２.６),梯度洗脱条件见表１;

 

    c)流速:０.３mL/min;d)柱温:３０°C;

 

    e)进样量:２μL.

 

表１液相色谱梯度洗脱条件