出口食品中产毒素真菌快速检测方法实时荧光PCR法

 

 

 

1、范围

 

    本文件规定了食品中产毒素真菌的实时荧光PCR方法。

 

    本文件适用于食品中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉、产玉米赤霉烯酮毒素禾谷镰刀菌、产单端孢霉烯族毒素禾谷镰刀菌的实时荧光PCR检测。

 

 

2、规范性引用文件

 

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

 

    GB4789.15 食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数

 

    GB4789.16 食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定

 

    GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

 

    GB19489 实验室生物安全通用要求

 

    GB/T27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测

 

 

 

 

3、术语和定义

 

    下列术语和定义适用于本文件。

 

3.1  实时荧光PCRrealtimePCR

 

    在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

 

3.2  CT值cyclethreshold

 

    每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

 

 

4、缩略语

 

    下列缩略语适用于本文件。

 

    aflR:产黄曲霉毒素调控基因(aflatoxinbiosynthesisregulatorygene)

 

    Ct值:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数(C:Cycle,t:threshold)

 

    DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

 

    dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)

 

    dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate)

 

    dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)

 

    dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)

 

    dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)

 

    dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)

 

    EDTA:乙二胺四乙酸(eathylenediaminetetraaceticacid)

 

    FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

 

    ITS:内部转录间隔区(internaltranscribedspacer)

 

    omt-1:柄曲霉素转甲氧基霉基因(sterigmatocystino-mcthyltransfcrasegene)

 

    PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

 

    PKS13:聚酮合成酶基因(polyketonesynthasegene)

 

    SDS:十二烷基磺酸钠(Sodiumdodecylsulfate)

 

    Tri5:单端孢霉烯前体合成酶基因trichodienesynthasegene

 

    Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)

 

    UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)

 

    ver-1:杂色曲霉素A脱氢酶基因(versicolorinAdehydrogenasegene)

 

 

5、方法原理

 

    本方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因:产黄曲霉毒素调控基因aflR,柄曲霉素转甲氧基酶基因omt-1和杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的有无来判断待检菌株是否能够产生黄曲霉毒素;选用单端孢霉烯前体合成酶基因Tri5的有无来判断待检菌株是否能够产生单端孢霉烯族毒素;选用聚酮合成酶基因PKS13的有无来判断待检菌株是否能够产生玉米赤霉烯酮毒素。另外,使用真菌共有的5.8  SrRNA的ITS序列作为内标基因。

 

 

 

 

6、主要设备及耗材

 

6.1  天平:感量0.1g。

 

6.2  均质器。

 

6.3  恒温摇床:25°C±1°C。

 

6.4  高速台式冷冻离心机(离心力12000g)。

 

6.5  涡旋振荡仪。

 

6.6  核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

 

6.7  生物安全柜。

 

6.8  实时荧光PCR仪。

 

6.9  不同量程移液器:100μL~1000μL、20μL~200μL、10μL~100μL、0.5μL~10μL。

 

6.10  离心管:2mL、1.5mL和0.2mL。

 

6.11  八连PCR管、不同量程移液器的配套吸头。

 

 

7、材料与试剂

 

    试剂在没有特殊说明的情况下为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

 

7.1  萨氏培养液:按照A.1执行。

 

7.2 DNA提取液:按照A.2执行。

 

7.3 RNA酶(10mg/mL)。

 

7.4  TaqDNA聚合酶。

 

7.5 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

 

7.6 10×PCR缓冲液:200mmol/LTris-HCL(pH8.4),200mmol/Lkcl,15mmol/LMgCl2。

 

7.7  阳性质控菌株:用产黄曲霉毒素菌株(如:黄曲霉标准菌株AspergillusflavusCGMCC3.4408或者寄生曲霉AspergillusparasiticusCGMCC3.124,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株),单端孢霉烯族毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株FusariumgraminearumCFCC80357,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株),产玉米赤霉烯酮毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株FusariumgraminearumCFCC80357,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。

 

7.8  阴性质控菌株:用不产黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮毒素菌株(如烟曲霉As-pergillusfumigatusCGMCC3.5301,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。

 

7.9  实验用引物探针序列及选用:对待检可疑菌,按照表1选用基因进行检测。基因的引物和探针按照表2中序列合成,加超纯水配制成100μmol/L储备液,实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。食品中产毒素真菌特征基因扩增靶标参考序列参见附录B。

 

 

 

 

8、试验操作步骤

 

8.1  样品制备

 

    按照GB4789.15中方法进行样品制备。

 

8.2  产毒素真菌的初步鉴定

 

    按照GB4789.16进行。

 

8.3  可疑产毒素真菌菌丝的培养

 

    在无菌条件下用灼烧过的接菌环挑取一环可疑产毒素真菌的孢子接种到装有5mL萨氏培养液的试管中,在25°C±1°C,180r/min,摇床培养48h。

 

8.4  DNA提取与纯化

 

    灭菌研钵用液氮预冷。从萨氏培养液中挑取菌丝(约0.3g)到研钵中。加液氮研磨菌丝至粉末状。加入500μLDNA提取液入研钵继续研磨使粉末状菌丝成悬浮液,将菌丝悬浮液吸入灭菌的2.0mL离心管中,加入5μLRNA酶,37°C水浴30min,加等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1),混匀,12000g离心10min,取上清液,加等体积的三氯甲烷-异戊醇(24∶1)混匀,12000g离心10min。取上清,加2.5体积无水乙醇,颠倒混匀后置于-20°C下保温1h。然后10000g离心10min,收集沉淀,用75%乙醇600μL洗涤后相同条件下再次离心5min。空气中干燥沉淀5min。用200μL超纯水溶解DNA,置于-20°C下保存备用。

 

    也可使用等效的商业化的真菌DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。

 

8.5  DNA浓度和纯度的测定

 

    样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值,按照公式(1)计算DNA的浓度。

 

ρ=A260×50..............................(1)

 

    式中:

 

    ρ———DNA浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

 

    A260———260nm处的吸光值。

 

    当DNA浓度在2μg/mL~50μg/mL,A260/A280在1.7~1.9之间时,适宜于实时荧光PCR检测。

 

8.6  实时荧光PCR检测

 

8.6.1  反应体系

 

    按照表3配制实时荧光PCR的最终反应体系。

 

8.6.2  反应参数

 

    95°C预变性2min;95°C变性5s,60°C退火延伸45s,同时收集FAM荧光,进行45个循环。

 

    注:以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同进行适当的调整。设置PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。

 

8.6.3  对照和平行

 

    检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以7.7中的相对应的阳性质控菌株DNA或含目的片段的质粒作阳性对照,7.8中阴性质控菌株DNA作阴性对照,用等体积的双蒸水代替DNA模板作为空白对照。每个待检样品应有2个平行实验。

 

 

9、结果分析与表述

 

9.1  质量控制

 

    空白对照:Ct值大于或等于40。

 

    阴性对照:ITS基因检测Ct值小于或等于30,其他基因检测Ct值大于或等于40。

 

    阳性对照:ITS基因检测Ct值小于或等于30,其他基因检测Ct值小于或等于35。

 

    以上质控条件有一项不符合者,实验结果视为无效,应查找原因再次进行实时PCR扩增。

 

9.2  结果分析

 

9.2.1  数据分析

 

    目标基因检测Ct值大于或等于40,ITS基因检测Ct值小于或等于30,则可判定该样品不含所检基因。

 

    目标基因检测Ct值小于或等于36,ITS基因检测Ct值小于或等于30,判定该样品含有所检基因。

 

    目标基因检测Ct值在36~40之间,应调整模板浓度,重做实时荧光PCR。再次扩增后的检测Ct值仍小于40,则可判定为该样品含有所检基因。再次扩增后的检测Ct值大于或等于40,则可判定为该样品不含所检基因。

 

9.2.2结果判定和报告

 

9.2.2.1  产黄曲霉毒素黄曲霉和寄生曲霉检测结果判定和报告。

 

    a)未检出aflR、omt-1、ver-1中任一基因,判定结果为阴性,可直接报告未检出产黄曲霉毒素黄曲霉和寄生曲霉。

 

    b) aflR、omt-1、ver-1基因均检出,判定结果为阳性。

 

9.2.2.2  产单端孢霉烯族毒素禾谷镰刀菌检测结果判定和报告。

 

    a)未检出Tri5基因,判定结果为阴性,可直接报告未检出产单端孢霉烯族毒素禾谷镰刀菌。

 

    b)检出Tri5基因,判定结果为阳性。

 

9.2.2.3  产玉米赤霉烯酮毒素禾谷镰刀菌检测结果判定和报告。

 

    a)未检出PKS13基因,判定结果为阴性,可直接报告未检出产玉米赤霉烯酮毒素禾谷镰刀菌。

 

    b)检出PKS13基因,判定结果为阳性。

 

9.2.2.4  阳性结果的确证和报告

 

    对于阳性结果,应参见规范性引用文件中的方法或相关的权威真菌毒素检验方法做进一步的确证和报告。

 

 

10、生物安全和防污染措施

 

    检测过程中的所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。

 

    防污染措施应符合GB/T27403的规定。

 

 

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