葡萄中赭曲霉毒素A的测定高效液相色谱法(www.xibiao-tech.com)

 

 

 

1  范围

 

     本文件规定了葡萄中赭曲霉毒素A的高效液相色谱测定方法。

 

    本文件适用于葡萄中赭曲霉毒素A的测定。

 

 

 

 

2  规范性引用文件

 

    下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注明日期的版本适用于本标准。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

 

    GB5009.96-2016食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定

 

    GB23200.121-2021食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法

 

    GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

 

 

 

3  原理、定义和先进性

 

3.1  原理和定义

 

     QuEChERS方法：利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化目的的前处理方法。试样用乙腈提取，然后使用萃取盐液液分层，采用分散固相萃取，使用石墨粉等吸附剂进行净化，取上层液进行高效液相色谱检测，外标法定量。

 

3.2  先进性

 

    （1）回收率高；（2）精确度和准确度高；（3）可分析的物质范围广；（4）分析速度快；（5）溶剂使用量少，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂；（6）操作简便，无需良好训练和较高技能便可很好地完成；（7）乙腈加到容器后立即密封，使其与工作人员的接触机会减少；（8）样品制备过程中仅使用很少的玻璃器皿，装置简单。

 

 

4  试剂和材料

 

4.1  试剂

 

    乙腈（色谱级）。

 

    甲酸（色谱级）。

    氯化钠（NaCl）。

 

    无水硫酸镁（MgSO4）。

 

    石墨粉（CAS:7782-42-5），纯度≥99.8%。

 

    注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

 

4.2  标准品

 

    赭曲霉毒素A（C20H18ClNO6,CAS号：303-47-9），纯度≥99%。

 

4.3  标准溶液配制

 

    取赭曲霉毒素A标准品1.0mg置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成浓度为100mg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，4°C下避光保存。

 

 

5  仪器和设备

 

5.1  液相色谱仪

 

    配有荧光检测器（FLD）。

 

5.2  离心机

 

    转速不低于12000r/min。

 

5.3  电子天平

 

    感量0.1mg和0.01g。

 

 

6  分析步骤

 

6.1  试样制备、提取与净化

 

6.1.1  试样制备

 

    样品测定部位按照GB2763-2021中附录A的规定执行。称取10.0g经料理机破碎的葡萄样品置于50mL离心管。

 

6.1.2  提取

 

    加入10mL乙腈（1%甲酸），手动震荡1min，再依次加入1.0g氯化钠、4.0g无水硫酸镁，手动震荡1min，在8000r/min离心5min。

 

6.1.3  净化

 

    取1mL6.1.2  部分上清液移入另一装有150mg无水硫酸镁和80mg石墨粉的2mL离心管中，手动震荡1min，12000r/min离心5min，用1mL注射器抽取上清液过0.22μm滤膜，待HPLC检测。

 

6.2  试样测定

 

6.2.1  高效液相色谱条件

 

    C18色谱柱（3.0mm×150mm，2.7μm），或相当者；流动相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；采用梯度洗脱，流速0.50mL/min；柱温30°C；进样量10μL；检测器FLD，激发波长Ex：334nm，发射波长Em：460nm。

 

    梯度洗脱程序：0min～5min：流动相A：50%，流动相B：50%，流量为0.5mL/min；5min～10min：流动相A：30%，流动相B：70%，流量为0.5mL/min；10min～15min：流动相A：10%，流动相B：90%，流量为0.5mL/min；15min～18min：流动相A：50%，流动相B：50%，流量为0.5mL/min。

 

6.2.2  基质匹配标准工作曲

 

    线选择与被测样品性质相同或相似的空白样品，按照步骤6.1  部分进行前处理，得到空白基质溶液。准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（4.3部分）用空白基质溶液稀释，分别配成相当于1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的基质匹配标准工作液，供高效液相色谱仪测定。以赭曲霉毒素A的色谱图峰面积为纵坐标，相对应的基质匹配标准工作溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。

 

6.2.3  色谱测定

 

   在6.2.1  色谱条件下，将基质匹配标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪，以赭曲霉毒素A的浓度（x，μg/L）为横坐标，对应色谱峰峰面积（y）为纵坐标，进行回归计算，绘制基质匹配标准工作曲线，基质匹配标准工作曲线按式（1）计算：

 

y=ax+b................................................................................(1)

 

    式中：

 

    y—赭曲霉毒素A的峰面积；

 

    a—基质匹配标准工作曲线斜率；

 

    x—赭曲霉毒素A的浓度，μg/L；

 

    b—基质匹配标准工作曲线截距。

 

6.2.4  定性和定量

 

6.2.4.1  定性

 

    保留时间，被测试样中赭曲霉毒素A的色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。

 

6.2.4.2  定量

 

    外标法，指按梯度添加一定量的标准品(对照品)于空白溶剂中制成对照样品，与未知试样平行地进行样品处理并检测。不同浓度的标准品进样，以峰面积为值绘制成标准曲线，从而推算出未知试样中被测组分浓度的定量方法。相对误差应在±1%之内。

 

6.2.5  试样溶液的测定

 

    将基质匹配标准溶液和试样溶液依次注入高效液相色谱仪中，待测样液中赭曲霉毒素A的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。

 

6.2.6  平行试验

 

    按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。

 

6.2.7  空白试验

 

    除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

 

 

7  结果计算

 

    试样中赭曲霉毒素A含量以质量分数计，单位为μg/kg，按公式（2）计算。

 

 

    ω—试样中被测物的数值，μg/kg；

 

    ρ—从基质匹配标准工作溶液中得到的试样溶液中被测物的质量浓度的数值，μg/L；

 

    V—提取液体积的数值，mL；

 

    m—试样质量的数值，g；

 

    计算结果以重复性条件下获得的至少3次独立测定结果的算术平均值表示，保留2位有效数字。

 

 

8  精密度和添加回收率

 

    样品中赭曲霉毒素A含量在重复性条件下获得的3次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%，参见附录A。

 

 

9  检出限

 

    以3倍的信噪比作为方法检出限，本方法的检出限为0.046±0.001μg/kg，参见附录B。

 

附录（资料性附录）

 

附录A

 

赭曲霉毒素A测定方法的精密度和添加回收率

 

加标水平，μg/kg	添加回收率，%			精密度，%
	葡萄1	葡萄2	葡萄3	葡萄1	葡萄2	葡萄3
1.5	87.4	101.8	104.9	3.7	3.3	3.4
15	96.4	108.3	99.6	4.5	3.2	3.9
40	95.9	100.4	100.5	3.4	3.5	4.0

 

 

 

附录B

 

毒素的英文名称和葡萄基质中的方法检出限

 

中文名	英文名	方法检出限，μg/kg
赭曲霉毒素A	Ochratoxin A	0.046	0.047	0.045

 

 

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