饲料脱霉剂霉菌毒素吸附率测定液相色谱串联质谱法

发布时间：2023-11-17 09:57:38

 

 

 

1  范围

 

本文件规定了液相色谱串联质谱法测定饲料脱霉剂霉菌毒素吸附率的原理、试剂与材料、仪器设备、试验步骤、结果计算和重复性。

 

本文件适用于饲料脱霉剂对黄曲霉毒素（AFB）B1、B2、G1和G2，玉米赤霉烯酮（ZEA），伏马毒素B1、B2、B3，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），赭曲霉毒素A、B和T-2毒素吸附率的测定。

 

 

测定实验

 

2  规范性引用文件

 

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

 

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

 

GB/T 14699.1饲料采样

 

 

3  术语和定义

 

下列术语和定义适用于本文件。

 

3.1  霉菌毒素吸附率  mycotoxin adsorption rate

 

在pH=3的缓冲溶液中饲料脱霉剂对霉菌毒素的吸附比率，以吸附前后标准溶液中霉菌毒素浓度的差值与吸附前霉菌毒素标准溶液浓度的比值表示。

 

 

4  原理

 

在pH=3模拟胃内环境的缓冲溶液中饲料脱霉剂与毒素标准液混合1小时后，离心取上清液，测定毒素的浓度，通过吸附前后标准溶液毒素浓度之差与吸附前标准溶液毒素浓度的比值计算。

 

 

5  试剂与材料

 

所用试剂除另有规定外，均使用分析纯试剂：

 

a）水：GB/T 6682，一级；

 

b）浓盐酸；

 

c）氯化钾；

 

d）磷酸二氢钾；

 

e）十二水磷酸氢钠；

 

f）氯化钠；

 

g）甲酸：质谱纯；

 

h）乙腈：质谱纯；

 

i）甲醇：质谱纯；

 

j）霉菌毒素标准品：纯度及相关信息见附录A；

 

k）盐酸溶液（2 mol/L）：移取16.8 mL盐酸于1 L容量瓶中，加水定容至刻度，混匀后备用；

 

l）磷酸缓冲液（pH=3）：称取0.2g氯化钾，0.2 g磷酸二氢钾，2.92 g十二水磷酸氢二钠，8g氯化钠，加950 mL水溶解，使用2 mol/L盐酸溶液调整至pH=3，最后用纯水定容到1000 mL；

 

m）提取液：量取159 mL水、840 mL乙腈和1 mL甲酸，混匀；

 

n）霉菌毒素储备液：按照附录A称取黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的标准品约0.0003g，称取赭曲霉毒素A、B，T-2毒素，玉米赤霉烯酮，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，伏马霉素B1、B2、B3的标准品约0.003，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解、定容，配制成混合霉菌毒素储备液；储备液中黄曲霉毒素的浓度约为30μg/mL，其余霉菌毒素浓度约为300μg/mL；

 

o）霉菌毒素标准溶液：准确移取100μL霉菌毒素储备液于10mL容量瓶中，用磷酸缓冲液（pH=3）定容，配制成混合霉菌毒素标准溶液，其中黄曲霉毒素的浓度约为30 ng/mL，其余霉菌毒素浓度约为300 ng/mL。

 

 

实验仪器展示

 

6  仪器设备

 

测试仪器设备有：

 

a）超高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）；

 

b）涡旋混合器；

 

c）振荡器；

 

d）离心机：转速不低于8000转/分钟；

 

e）真空浓缩仪或氮吹仪；

 

f）分析天平：感量0.0001g和0.00001g；

 

g）天平：感量0.01g。

 

 

7  试验步骤

 

7.1  取样

 

按GB/T 14699.1的规定均匀取样。

 

7.2  混合吸附

 

称取1g（精确至0.0001 g）样品于10ml的离心管中，加入5ml霉菌毒素标准溶液，涡旋混匀，置于恒温摇床中37°C，200转/分钟条件下，混合1小时；于8000 转/分钟离心5 分钟，取上清液，于60°C真空浓缩或氮吹至近干，备用。

 

7.3  提取

 

准确加入20 mL提取液，涡旋混匀，振荡提取20分钟，于8000 转/分钟离心5 分钟，立即移取上清液，备用。

 

7.4  霉菌毒素标准溶液净化液制备

 

取霉菌毒素标准液5 ml，于60°C真空浓缩或氮吹至近干，按7.3提取，得到霉菌毒素标准溶液净化液，待测。

 

7.5 测定

 

7.5.1超高效液相色谱参考条件：

 

——色谱柱：C18柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径1.7 μm～1.9 μm，或性能相当者；

 

——柱温：40°C；

 

——流速：0.3 ml/mL；

 

——进样量：1 μL；

 

——流动相：A相：准确吸取1 mL甲酸（质谱纯），用超纯水稀释并定容至1000 mL，混匀；

 

B相：乙腈（质谱纯），梯度洗脱程序见下表1。

 

表1  梯度洗脱程序

 

 

时间min A％ B％
0

95

5
2

80

20
4

65

35
6 30 70
8 0 100
10 0 100

 

 

7.5.2质谱参考条件：

 

——电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+），负离子模式（ESI-）；

 

——检测方式：平行反应监测（PRM）；

 

——毛细管电压：3.5kV；

 

——离子源温度：300°C；

 

——辅助气温度：350°C；

 

7.5.3在仪器的最佳条件下，分别取霉菌毒素标准溶液净化液（7.5）或吸附后上清液（7.4）上机测定，霉菌毒素相关检测指标信息见附录B。

 

 

8  结果计算

 

8.1 吸附后上清液中霉菌毒素浓度，按式（1）计算：

 

结果计算式 ................................................（1）

 

 

 

式中：

 

Ai——吸附后上清液中霉菌毒素的峰面积；

 

Asi——标准溶液净化液中霉菌毒素的峰面积；

 

C0——标准溶液中霉菌毒素浓度（ng/mL）。

 

8.2 饲料脱霉剂霉菌毒素吸附率，按式（2）计算：

 

结果计算式 ................................................（2）
 

式中：

 

X——饲料脱霉剂毒素吸附率％；

 

C0——标准溶液中毒素浓度（ng/mL）；

 

C1——吸附后上清液中毒素浓度（ng/mL）。

 

 

9  重复性

 

在重复条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算数平均值的10％。

 


附录A


（规范性）


霉菌毒素相关名称、分子式等信息对照表


表A.1霉菌毒素中文名称、英文名称、分子式、分子量和标准品纯度

 

序号 中文名称 英文名称

分子式

分子量

CAS号

纯度％
1

黄曲霉毒素B1

Aflatoxin B1

C17H12O6

312.3

1162-65-8

99
2

黄曲霉毒素B2

Aflatoxin B2

C17H14O6

314.3

7720-81-7

99
3

黄曲霉毒素G1

Aflatoxin G1

C17H12O7

328.3

1165-39-5

99
4 黄曲霉毒素G2 Aflatoxin G2

C17H14O7

330.3

7241-98-7

99
5 玉米赤霉烯酮 Zearalenone C18H22O5 318.4 17924-92-4 99
6 赭曲霉毒素A OchratoxinA C20H18ClNO6 403.8 303-47-9 99
7 赭曲霉毒素B OchratoxinB C20H19O6 369.4 4825-86-9 99
8 T-2毒素 T-2 toxin C24H34O9 466.5 21259-20-1 99
9 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 Deoxynivalenol C15H20O6 296.3 51481-10-8 99
12 伏马霉素B1 Fumonisin B1 C34H59O15 721.8 116355-83-0 99
13 伏马霉素B2 Fumonisin B2 C34H59O14 705.8 116355-84-1 99
14 伏马霉素B3 Fumonisin B3 C34H59O14 705.8 136379-59-4 95

 

 

 

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