饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的测定 高效液相色谱法

 

 

 

1、范围

 

    本文件描述了饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的高效液相色谱测定方法。

 

    本文件适用于饲料添加剂淫羊藿提取物中5种黄酮醇苷(淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定 B、朝藿定C和宝藿苷D)的测定。

 

    本文件中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷定量限均为0.2g/kg。

 

 

2、规范性引用文件

 

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

 

    GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

 

    GB/T20195动物饲料试样的制备

 

 

 

 

3、术语和定义

 

    本文件没有需要界定的术语和定义

 

 

4、原理

 

    试样中的黄酮醇苷用甲醇溶液提取,高效液相色谱仪测定,外标法定量

 

 

5、试剂或材料

 

    除非另有规定,仅使用分析纯试剂:

 

5.1  水:GB/T6682,一级。

5.2  甲醇:色谱纯。

5.3  乙腈:色谱纯。

5.4 70%甲醇溶液:量取700mL甲醇(5.2)于1000mL,容量瓶中,加水定容,混匀。

 

5.5  标准储备溶液(2mg/mL):准确称取淫羊藿苷(CAS:489-32-7,纯度>96%)、朝藿定A(CAS110623-72-8,纯度>95%)、朝藿定B(CAS:110623-73-9,纯度>95%)、朝藿定C(CAS:110642-44-9,纯度>95%)、宝藿苷I(CAS:113558-15-9,纯度>95%)各20mg(精确至0.01mg),分别置于10ml,棕色容量瓶中,用甲醇(5.2)溶解并定容,混匀。-18℃以下保存,有效期3个月。

 

5.6  混合标准中间溶液(200mg/1):分别准确移取标准储备溶液(5.5)各1ml于10ml,棕色容量瓶中,用70%甲醇溶液(5.4)定容,混。于2℃~10℃保存,有效期3个月。

 

5.7  混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液(5.6),用70%甲醇溶液(5.4)配制成质量浓度分别为0.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L和200 mg/L混合标准系列溶液。临用现配。

 

5.8  微孔滤膜:0.45 μm,有机系。

 

6、仪器设备

6.1  高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

6.2  分析天平:精度0.1mg和0.01 mg。

6.3  超声波清洗器。

6.4  离心机:转速不低于4000r/min。

6.5 涡旋混匀器。

 

7、样品

    按GB/T 20195制备样品,至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛,充分混匀,装入密闭容器中,避光保存,备用。

 

8、试验步骤

8.1  提取

    平行做2份试验。称取0.25g试样(精确至0.1mg),置于50mL离心管中,加人30 mL 70%甲醇溶液(5.4),涡旋混匀1min,超声提取10min。于4000r/min离心5min,将上清液转移至 100 ml,容量瓶中,残渣再用30mL, 70%甲醇溶液(5.4)提取,重复上述操作,合并上清液,用70%甲醇溶液(5.4)定容,混匀。移取适量提取液,4 000r/min离心5min,用微孔滤膜(5.8)过滤,备用。宜20h内上机测定。

8.2  色谱参考条件

    色谱参考条件如下:

    a)色谱柱:C柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或性能相当者;流动相:A相为水(5.1),B相为乙腈(5.3),梯度洗脱程序见表1;)

    c)流速:1 mL/min;

    d)柱温:30℃;

    进样量:20μL;e)

    检测波长:270nm。

 

表1 梯度洗脱顺序

 

时间/min	A相/%	B相/%
0	75	25
15	75	25
23	70	30
33	48	52
40	48	52
41	75	25
45	75	25

 

8.3  测定

8.3.1 混合标准系列溶液和试样溶液测定

    在仪器的最佳条件下,分别取混合标准系列溶液(5.7)和试样溶液(8.1)上机测定。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I混合标准溶液的高效液相色谱图见附录A。

8.3.2  定性

    在相同试验条件下,试样溶液中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷1的保留时间应与混合标准系列溶液(质量浓度相当)所对应组分的保留时间一致,其相对偏差在士2.5%之内。

 

8.3.3  定量

    分别以淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷1的质量浓度为横坐标、对应的色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其线性相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内,如超出范围,用70%甲醇溶液(5.4)稀释后重新测定。单点校准定量时,试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。

 

 

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