蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定 液相色谱-串联质谱法

 

 

 

1、范围

    本文件规定了蜂蜜中葫芦巴碱含量的液相色谱-串联质谱测定方法。

    本文件适用于蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定。

 

2、规范性引用文件

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

    GBTT6682分析实验室用水规格和试验方法

 

3、术语和定义

    本文件没有需要界定的术语和定义。

 

4 原理

    试样用 0.1%甲酸溶液溶解，其中葫芦巴碱经阳离子固相萃取柱提取净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

 

5 试剂和材料

    除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GBIT6682规定的一级水。

 

5.1 试剂

5.1.1 甲酸(CHzOz):色谱纯。

5.1.2 甲醇(CHOH):色谱纯。

5.1.3 氨水(NH3HzO)

5.1.4 乙腈(CHCN):色谱纯。

5.1.5 乙酸铵(CHCOONH):色谱纯。

5.2 溶液配制

5.2.1 0.1%甲酸溶液:取1mL甲酸(5.1.1)于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。

5.2.2 2%氨水甲醇溶液:取2mL氨水(5.1.3)于100mL容量瓶中，用甲醇(5.1.2)定容至刻度，混匀。

5.2.3 80%甲醇水溶液:取80mL甲醇(5.1.2)于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。5.2.45mmol/L乙酸铵溶液:称取0.385g乙酸铵(5.1.5)于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀。

5.3 标准品

 

5.3.1 葫芦巴碱(Trigonelline，CHNO2，CAS号:535-83-1，纯度>99%)。

 

5.3.2 葫芦巴碱-d3(Trigonelline-d3，CHDNOz，纯度>98%)

5.4 标准溶液配制

5.4.1 葫芦巴碱标准储备液(1mg/mL):准确称取葫芦巴碱(5.3.1)标准品 10mg(精确至 0.01 mg)，置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为1 mg/mL的葫芦巴碱标准储备液，2~8℃C条件下保存，有效期6个月。

5.4.2 葫芦巴碱-d储备液(1mg/mL):准确称取葫芦巴碱-d3(5.3.2)标准品10mg(精确至 0.01mg)，置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为1mg/mL 的葫芦巴碱-dg储备液，2~8℃℃条件下保存。

5.4.3 葫芦巴碱标准中间溶液:准确移取葫芦巴碱标准储备液(5.4.1)100，于10mL 容量瓶中，用80%甲醇水溶液(5.2.3)稀释并定容，混匀后配制成浓度为10ug/mL的葫芦巴碱标准中间溶液，2-8℃条件下保存，有效期3个月。

5.4.4 葫芦巴碱-d,中间溶液:准确移取葫芦巴碱-d3标准储备液(5.4.2)100，于10mL 容量瓶中,用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀释并定容,混匀后配制成浓度为10μg/mL 的葫芦巴碱-dg中间溶液,2~8℃条件下保存。

5.4.5 葫芦巴碱标准工作溶液:分别移取葫芦巴碱标准中间溶液(5.4.3)10mL、20 mL、50 μL、100μL、200 μL、500μL至 10 mL容量瓶中，并分别加入 100μL葫芦巴碱-d,中间溶液(5.4.4)，用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀释至刻度,分别配制成浓度为 0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL,的葫芦巴碱标准工作溶液(葫芦巴碱-d,浓度均为0.1 Hg/mL)，用于绘制标准工作曲线。标准工作溶液现用现配。

5.5 材料

5.5.1 强阳离子固相萃取柱:60mg/3 mL，或相当者。

5.5.2 微孔滤膜:有机系，规格0.22 mm。

 

6 仪器和设备

6.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源

6.2 分析天平:感量0.01g和 0.000019

6.3 涡旋混合器。

6.4 固相萃取装置。

6.5 氮吹仪。

6.6 容量瓶:10mL、50 mL、100 mL、1000 mL。

 

7 试样制备与保存

7.1 试样的制备

 

    对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出200g作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。

 

7.2 试样的保存

试样于常温下保存。

 

8 测定步骤

 

8.1 提取

称取蜂蜜样品2g(精确至0.01g)至烧杯中，加入适量0.1%甲酸溶液溶解并转移至50mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液冲洗烧杯两次并转移至容量瓶中，定容，混匀。含量超出线性范围的样品需适当倍数稀释。然后取 1.0mL溶液于样品瓶中，向其中加入 10L 葫芦巴碱-dg中间溶液(5.4.4)，混匀后待固相萃取净化。

 

8.2 净化

强阳离子固相萃取柱(5.5.1)依次用3mL甲醇活化和3mL水平衡，上述加入内标的提取液上样至固相萃取柱，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL2%氨水甲醇溶液(5.2.2)洗脱。收集洗脱液，50“条件下氮气吹干。加入80%甲醇水溶液(5.2.3)1mL，涡旋1min 溶解残余物，微孔滤膜(5.5.2)过滤，液相色谱-串联质谱仪测定。

8.3 测定

8.3.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱:HILIC柱(2.1mmx100mm，1.7m)，或相当者:

 

b)流动相:A相为乙腈(5.1.4)，B相为5mmol/L乙酸铵溶液(5.2.4)，梯度洗脱条件见表 1:

 

c)流速:0.3mL/min;

 

d)柱温:40℃℃:

 

e)进样量:2μL。

表1梯度洗脱条件(A:乙腈;B:5mmol/L乙酸铵溶液)

 

时间/min	流速（mL/min）	A（%）	B（%）
0	0.3	90	10
0.5	0.3	90	10
1.5	0.3	90	50
3.5	0.3	90	50
4.0	0.3	90	10
6.0	0.3	90	10

 

8.3.2 质谱参考条件

 

a)离子源:电喷雾离子源(ESI);

 

    b)扫描方式:正离子扫描;

    c)检测方式:多反应监测(MRM)，葫芦巴碱和葫芦巴碱-d:的MRM 参数见表2:

    d)离子源温度:120℃C;

    e)脱溶剂温度:350℃C:

    f)脱溶剂气体流速:650 L/h;g)毛细管电压:3kV。

表2葫芦巴碱及葫芦巴碱-d的多反应监测(MRM)参数

 

化合物名称	定性离子对（m/z）	定量离子对（m/z）	锥孔电压（V）	碰撞能量（eV）
葫芦巴碱	138.0/78.0	138.0/92.0	50	22
	138.0/92.0			20
葫芦巴碱-d3	141.0/97.1	141.0/95.1	50	20
	141.0/95.1			20

 

 

8.4 液相色谱-串联质谱测定

 

8.4.1 定性确证

    每种被测组分选择一个母离子，两个及以上子离子，在相同实验条件下，试样溶液中葫芦巴碱和葫芦巴碱-d的保留时间与标准溶液中相应组分的保留时间一致，相对偏差在22.5%之内，所有离子对都出现，且相对离子丰度与浓度相当的标准溶液相对离子丰度一致，其允许偏差应符合表3的要求。

 

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

 

相对离子丰富度	>50%	>20%~50%	>10%~20%	≤10%
最大允许偏差	±20%	±25%	±30%	±50%

 

8.4.2 定量测定

    按照8.3.1和8.3.2设定仪器条件，以目标物的质量浓度为横坐标，以目标物峰面积与同位素内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，按内标法计算试样中目标物的含量。标准溶液及试样溶液中的目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。

8.5 平行试验

    按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

 

8.6 空白试验

    除不称取样品外，均按上述相同条件和步骤进行。

 

 

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