动物源性食品中氯霉素和甲硝唑残留量的测定液相色谱-串联质谱法

 

 

 

1、范围

 

    本方法适用于液相色谱-串联质谱对氯霉素和甲硝唑抗生素残留量的同时测定。

 

    本标准适用于猪、牛、鸡、鸭、鱼、虾、贝类中氯霉素和甲硝唑抗生素残留量的测定。

 

 

 

2、规范性引用文件

 

    下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

 

    GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则

 

    GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定

 

    GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留测定液相色谱-质谱/质谱法

 

    GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测

 

 

3、术语和定义

 

    本文件没有需要界定的术语和定义。

 

 

4、原理

 

    采用乙酸乙酯提取试样中氯霉素和甲硝唑药物残留，经低温离心，正己烷除油，氮吹、定容后，用液相色谱-串联质谱测定目标物，内标法定量。

 

 

5、试剂

 

    除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

 

5.1  乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。

 

5.2  正己烷（C6H14）：色谱纯。

 

5.3  乙腈（C2H3N）：色谱纯。

 

5.4  乙酸铵（C2H7NO2）：色谱纯。

 

5.5  氢氧化铵（NH3OH，浓度为25%~28%）。

 

5.6  无水硫酸钠（Na2SO4）：使用前经马弗炉550°C灼烧2h，冷却后密封保存。

 

5.7  5mmol/L乙酸铵溶液：称取0.39g乙酸铵，用水稀释至1000mL，混匀。

 

5.8  氯霉素（C11H12Cl2N2O5，CAS:56-75-7）、D5-氯霉素（C11H7Cl2D5N2O5，CAS:202480-68-0）、甲硝唑（C6H9N3O3，CAS:443-48-1）、D4-甲硝唑（C6H5D4N4O3，CAS:1261392-47-5）标准物质：纯度≥98%

 

5.9  标准储备液：1000mg/mL。分别准确称取氯霉素、甲硝唑、D5-氯霉素、D4-甲硝唑标准品10.0mg（按照纯度示值折算），用甲醇溶解并定容至10mL，配成1000mg/mL的标准储备液，-20°C以下避光保存，保存期为12个月。

 

5.10  混合标准储备液：分别准确吸取100μL氯霉素、甲硝唑标准储备液，用甲醇定容至10mL，配成浓度为10mg/L的混合标准储备液，-20°C以下避光保存，保存期为6个月。

5.11  混合内标储备液：分别准确量取100μLD5-氯霉素、D4-甲硝唑标准储备液，用甲醇定容至10mL，配成10mg/L的混合内标储备液，-20°C以下避光保存，保存期为6个月。

 

5.12  标准使用液：准确吸取混合标准储备液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，标准使用液质量浓度为0.05mg/L，4°C保存，保存期为7天。

 

5.13  内标使用液：准确吸取混合内标储备液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，内标使用液质量浓度为0.05mg/L，4°C保存，保存期为7天。

 

1.14  混合标准工作液：分别准确吸取标准使用液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL，内标使用液各40μL，用10%乙腈-水溶液定容至1.0mL，配制成氯霉素、甲硝唑含量为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL标准系列，其中内标浓度为2ng/mL。临用现配。

 

 

6  仪器

 

6.1  天平：感量为0.01g，0.1mg

 

6.2  组织捣碎机

 

6.3  涡旋混匀器

 

6.4  超声波清洗器

 

6.5  离心机：≥14000r/min

 

6.6  氮吹仪

 

6.7氮气发生器

 

6.8  液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源

 

 

7  试样制备与保存

 

7.1  试样的的制备

 

    取样品约500g用肉类组织捣碎机绞碎，装入洁净容器作为试样，密封并标明标记。

 

7.2  试样的的保存

 

  将试样于-18°C冰箱中保存。

 

 

8  测定步骤

 

8.1  提取称取5g（精确到0.01g）已经均质好的样品于50mL离心管中，加入80μL内标标准使用液、15mL乙酸乙酯、0.5mL氢氧化铵、足量的无水硫酸钠，涡旋混匀，超声提取30min。在14000r/min，5°C下离心15min，将上清液转移至另一干净的离心管中，再在样品管中加入上述试剂，重复提取一次。合并两次提取的上清液，于50°C氮气吹干。

 

8.2  净化将离心管中的残渣用2mL5%乙腈-水溶液溶解，涡旋30s，超声1min，加入5mL正己烷，涡旋30s，在14000r/min，5°C离心15min，弃去正己烷，重复操作3次。取水层过0.22μm的尼龙滤膜，收集滤液待上机。

 

8.3  测定条件

 

8.3.1  液相色谱条件

 

    a)色谱柱：C18(十八烷基硅烷，5μm，2.1×150mm)，或相当者；

 

    b)流动相：A相5mmol/L的乙酸铵溶液，B相为乙腈。流速为0.3mL/min，梯度洗脱见表1；表1梯度洗脱程序

 

    c)柱温：40°C；

 

    d)进样量：5μL。

 

 

图A.1氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反应监测（MRM）色谱图

 

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